细胞鉴定 - 百度文库

来自 : 发布时间：2024-05-10

细胞鉴定 成骨细胞鉴定： 1. Giemsa 染色： 将纯化后的第 2 代细胞调整细胞浓度至 5×107 L-1，接种到 12 孔细胞培养板中， 每孔接种 0.75 mL，以后每 3 d 换液。待细胞分布均匀、约 80%融合时，PBS 洗 3 次， 甲醇固定 10 min，Giemsa 染液染 2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。 2. 碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色： 细胞接种方法同上，体积分数 95%乙醇固定 30 min，按碱性磷酸酶活性检测试剂盒 要求进行检测。核固红复染细胞核，自然干燥后中性树胶封固。阳性细胞可见蓝黑色 颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位。 3. 钙化结节染色(茜素红法)： 细胞接种方法同上，弃培养基，培养板用 PBS 冲洗 2 次，体积分数 95%乙醇固定 30 min，蒸馏水冲洗 3 次，0.1%茜素红[茜素红-Tris-Hcl(pH 8.3)]染色，37 ℃，30 min， 蒸馏水冲洗。低倍镜视野(×40)下进行矿化结节观察。 4. Von Kossa’s 矿化结节染色法： 细胞接种方法同上， 弃培养基， 培养板用 PBS 冲洗 2 次， g/L 多聚甲醛固定标本， 40 5%硫代硫酸钠孵育 30 min， 蒸馏水冲洗， 然后用 1%硝酸银溶液紫外线下染色 30 min， 蒸馏水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质，继续用 5%硫代硫酸钠染色 2 min，1%中性 红复染 10 min，蒸馏水漂洗后观察。 5. 成骨细胞扫描电镜表面形态观察： 培养 24 h 后取出预先置培养板内的圆盖玻片( 直径 9 mm)，用 PBS 冲洗 3 次，加 入 3%戊二醛固定 2 h；用 PBS 冲洗 3 次，45 min/次。加入 1%锇酸，固定 2 h。体积 分数为 50%，70%，80%，90%，95%的乙醇逐级脱水，各 15 min；体积分数 100%乙 醇脱水 2 次(15 min/次)。醋酸异戊酯 15 min。CO2 临界点干燥，黏附于载物台上真空 镀膜仪镀金，扫描电镜观察并摄片。 6. 成骨细胞透射电镜超微结构观察： 消化收集细胞，1 000 r/min 离心 5 min 弃上清；前固定：加入预冷的固定液 3%戊 二醛固定 2 h。漂洗：弃戊二醛，将细胞团块挑出，包入擦镜纸内， 装入小瓶中， 加入 PBS 过夜。去除液体，PBS 漂洗，重复 3 次( 支持细胞的鉴定 牛睾丸支持细胞的鉴定 从体外培养形态而言, 间质细胞呈多角形或椭圆形, 细胞核大而圆, 相差显微镜可见 胞质内有较多的脂滴; 生精细胞呈圆形, 以链式或松散形式存在; 成纤维细胞呈梭形或扁 的星状, 具有突起。所以从形态学上不能准确判断 Sertoli 细胞。根据牛睾丸支持细胞相 关特性可以使用下面三个方法鉴定支持细胞。 福尔根染色 原理： Sertoli 细胞核内存在双极小体结构, 而在间质细胞、成纤维细胞和生精细胞内部 不存在这种结构。 采用 Feulgen 染色可以鉴定 Sertoli 细胞核中的卫星核小体, 其基本原 理是: 在 60 条件下, DNA 分子中嘌呤碱和脱氧核糖之间的氢键可被 1 mol/ L 盐酸水解打 开, 游离出的脱氧核糖醛基能与希夫( Schiff) 试剂结合, 形成紫色复合物。由于从睾丸分 离的细胞中, 只有 Sertoli 细胞核内存在卫星核小体结构, 能够在细胞核核仁两侧观察到 粉色的核小体 结构, 从而使其区别于其他细胞类型。在 Feulgen 染色过程中, 精准地控制 反应体系中的盐酸浓度和的水解时间, 是这种方法能够区分出双极核小体的关键。 器材： ①细胞洗液 PBS（—） ：1L 水+ 8g Nacl + 0.2g Kcl + 1.42g Na2HPO4 + 0.27g KH2PO4 ②Carnoy 固定液：无水乙醇 60 mL+ 冰醋酸 10 mL+ 氯仿 30 mL。 ③蒸馏水 1mol/L 盐酸 ④ Schiff 试剂：5 g/L 碱性品红溶液 100 mL 煮 5 min,冷却至 50 时过滤。滤液+ 1 mo l/ LHCl 10 mL+ 1. 5 g 偏重亚硫酸钠（Na2S2O5） 。在棕色瓶内密封保存 1~ 3 d 至颜色变为淡 黄色。 ⑤福尔根清洗液：100 g / L 亚硫酸钠溶液 5mL+ 1 mo l/ L 盐酸 5 mL+ 蒸馏水 100 mL。 ⑥乙醇 步骤：原代细胞长满后, 进行细胞传代培养, 待细胞长满后去除培养液, 并用 PBS( - ) 冲 洗 3 次, 进行福尔根染色 ①用 Carnoy 液固定 20 min; ②弃去固定液并用蒸馏水漂洗 1 min; ③用 1 mol/L 盐酸( 预热)与贴壁 细胞 60℃ 孵育 8 min; ④弃去盐酸并加入 Schif f 试剂, 细胞活性鉴定 1、细胞活性的鉴定：死细胞对许多抗体均有很强的非特异性染色，这就使样本细胞活性检测变得非常重要，尤其 是经过长时间运输和储存的样本。检测的方法通常有两种： （1）实时的流式检测：利用荧光染料 PI、7-AAD 或 EMA 进行死细胞染色，而活细胞拒染这些染料。此方法的优势是细胞表面标志和活性分析可同时进行。尤其适用于高度 坏死的样本。 7-AAD 最常用， 因为在 488nm 激发下， 其最大发射光在 670nm 左右， 适合与 FITC 或 PE 进行多色标记。 但随着时间延长，7-AAD 会在固定的细胞群体重新分配，死活细胞的区分变得困难。因此，对于染色并在固定后 12 小时以上分析的标本，最好用 EMA。EMA 与死细胞 DNA 稳定的共价结合保证了长时间固定后仍能很好的区分固定 前的死活状态。 （2）手工检测：使用 Trypanblue 或其他细胞活性染料。 （3）使用专门的仪器进行检测。如 Vi-cell。 2、7-AAD （7-amino-actinomycin D）是一种核酸染料，在流式细胞术中用于鉴定死细胞，这种作用与 PI 相似。它不 能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对 7-AAD 的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中 DNA 的有控 降解，在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光，通过 7-AAD 标记 DNA 的强弱，将细胞分为三群：7-AAD 强为死亡细胞，7-AAD 弱是凋亡细胞，7-AAD-为正常活力细胞。7-AAD 同 PI 有着相似的荧光特性，但其发射波谱较 PI 窄，PI 检测时同时占据 FL-2 和 FL-3 通道，而 7-AAD 只占 FL-3 通道，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分 析中是 PI 的最佳替代品，可与 Annexin V-EGFP/FITC/PE 联合使用。 3、Annexin V-PE/7-AAD 细胞凋亡检测试剂盒是用红色荧光染料 PE（Phycoerythrin）标记的 AnnexinV 作为探针，来 检测细胞早期凋亡的发生，可用荧光显微镜、流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。 其检测原理为：在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的 细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin- 细胞学鉴定 创新助手报告 ——主题分析报告 创新助手平台提供 北京万方软件股份有限公司 2014-06-27 报告目录 报告核心要素......................................................................................................... I 一、主题简介........................................................................................................ 1 二、主题相关科研产出总体分析........................................................................ 1 2.1 文献总体产出统计 ................................................................................ 1 2.2 学术关注趋势分析 ................................................................................ 2 三、主题相关科技论文产出分析........................................................................ 2 3.1 中文期刊论文 ........................................................................................ 2 3.1.1 近十年中文期刊论文分布列表 ................................................. 2 3.1.2 中文期刊论文增长趋势 ............................................................. 3 3.1.3 发文较多期刊 ............................................................................ 死活细胞鉴定 生物探究活动——鉴定植物细胞的死活 【实验目的】学习用质壁分离法和用活体染色法鉴定细胞死活 【实验原理】活细胞的原生质层具有选择透过性；而死细胞则为全透性。选择透 过性是质壁分离的先决条件。 因此能发生质壁分离的细胞就表示是活的，不能发 生质壁分离的细胞则说明是死的。 死活细胞间不仅通透性不同，而 pH 值等情况也不同，它们对某些染料的反 应明显不同。某些染料能在活细胞的细胞液中积累，但不能染活的原生质；另一 方面，这些染料可使死细胞的结构染色，但不积累于液泡。所以可根据某些染料 活体染色的情况来鉴定细胞死活。 【实验材料和用具】 洋葱及其它植物材料、酒精灯、显微镜、刀片、镊子、载 玻片、盖玻片、1M 蔗糖溶液、0.01%中性红溶液等。 【实验步骤】 1、用质壁分离的方法鉴定细胞的死活。 撕洋葱表皮细胞滴加 1M 蔗糖溶液，在显微镜下观察。细胞很快发生质壁分 离，这就是细胞活着的证据。另把制取的同样制片，用冷冻、加热、干燥、酒精 浸泡等方法将它们的细胞杀死，然后取代上述活材料，做质壁分离实验，结果看 到已死的细胞不能发生质壁分离现象。 用尿素、硝酸钾、氯化钙溶液等来代替蔗糖溶液，能快速鉴定细胞的死活。 2、用活体染色的方法的鉴定细胞的死活。 取洋葱或其它材料，用镊子撕下表皮（如表皮不易撕下，也可在水中用锋利 的刀片轻轻刮去多余部分），或用刀片做成切片若干，将表皮或切片浸入中性红 溶液中，放置 5-10 分钟最后用清水浸洗后置于载玻片上，加盖玻片，在显微镜 下观察。 活细胞的液泡内染成红色至紫色，原生质不染色，死细胞常呈橙红色，原生 质和细胞核被染色。撕破的细胞，只剩细胞壁时，呈淡红色或淡紫色。 为进一步鉴别细胞的死活， 可把玻片上的水溶液吸去，滴一滴 1M 蔗糖溶液， 便可观察到活细胞能发生质壁分离， 死细胞及只剩细胞壁的空细胞都有没有这种 现象。 可用加热、冷冻或其它方法杀死植物组织，然后用上面所述方法进行处理， 比较与活组织有何不同。 注：1 台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。是一种低毒的活 体染色剂，它只能透过质膜受损的细胞或死细胞，而正常的细胞能加以排除，即：死细胞着 色而活细胞不着色。故用于死活细胞的鉴定。甲基蓝有类似的染色机理. 2 死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒 染料，氧化型为蓝色 细胞死活鉴定 山东大学实验报告 2015 年 3 月 30 日 姓名 陈傲蕾 系年级 13 级生科 同组者 学号 科目 细胞生物学实验 题目 细胞培养与细胞死活鉴定 【实验目的】 1、回顾细胞培养的有关知识； 2、学习小鼠脾细胞的分离技术及简单的细胞培养技术 3、掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用； 4、了解细胞原代培养的基本方法及操作过程； 5、学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法； 6、学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数； 7、学习实验过程的详细描述及实验记录。 【实验原理】 细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的 生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰 蛋白酶消化或机械分散等方法， 将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞 的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单 层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以 1：2 或其他比例转 移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细 胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体， 在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体 内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究， 则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外 培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和 防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向 有利于人类健康长寿的方向发展。 因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常 重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：① 细胞膜通透性的差 异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地 通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、 苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态 的方法，上述染料能使 细胞死活鉴定 1、回顾细胞培养的有关知识； 2、学习小鼠脾细胞的分离技术及简单的细胞培养技术 3、掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用； 4、了解细胞原代培养的基本方法及操作过程； 5、学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法； 6、学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数； 7、学习实验过程的详细描述及实验记录。 【实验原理】 细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生 理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物 细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶 消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称 为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时， 用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以 1：2 或其他比例转移到另一个容 器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内 的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要 方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的 活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种 疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类 健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手 段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：① 细胞膜通透性的差异： 活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过； 而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、 赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上 述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定 植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性 已遭破坏， 细胞STR鉴定 细胞 STR 鉴定 服务编 号 CES01 CES02 CES03 服务项目 人类细胞 20 个 基因座检测 小鼠细胞检测 人鼠细胞交叉 污染检测 内容说明 满足常规人类细胞鉴定 需要 特异检测小鼠细胞交叉 污染 检测人类细胞和小鼠细胞 交叉污染 价格 1500 元 /株 1500 元 /株 2000 元 /株 周期 3-5 工作 日 7 工作日 7 工作日 背景介绍： 应用于生物医学研究领域的哺乳动物细胞被错误鉴定和交叉污染的问题， 一 直是一个普遍存在的突出问题。 据统计， 国外实验室有 20%左右的细胞株被错误 鉴定和交叉污染， NIH 和 ATCC 近两年都对此发出呼吁， 要求研究者对细胞进行 鉴定。近年来，大量研究表明 STR 基因分型方法是进行细胞交叉污染和性质鉴 定的最有效和准确的方法之一，STR 基因分型应用于细胞鉴定已被 ATCC 等机 构强烈推荐。 阅微基因作为 ATCC 标准委员会成员， 在国内率先推出了细胞 STR 鉴定服务并与多家研究机构、细胞中心、生产厂商等建立长期合作关系。 高度丰富信息：同时分析多个 STR 基因座，可以准确的判断交叉污染和细 胞类型。 高度灵敏：可以检测最低 0.1ng DNA（约 15 个二倍体基因组） ，微量样本即 可满足需求，并且可以检测到早期污染。 高通量和系统化平台： 采用自动化分析系统可大量检测及数据分析，结果更 加准确、客观。 服务项目： 1. 人类细胞 20 个基因座检测： 是目前基因座最多的检测服务，所选用的基因座不仅包含 ATCC 和 JCRB 细 胞库中的基因座， 更添加 4 个高度多态性位点——D19S433、 D6S1043、 D12S391 和 D2S1338，可方便与权威数据库进行比对，具有极高的准确性。位点如下： D5S818 TH01 FGA D3S1358 D13S317 AMEL D18S51 Penta D D7S820 TPOX D21S11 D6S1043 D16S539 CSF1PO D8S1179 D12S391 vWA D19S433 Penta E D2S1338 2．小鼠细胞检测 利用阅微基因专利产品分析小鼠基因组中 8 个高度多态性位：D1Mit159.1、 D2Mit395.1、 D4Mit170.1、 D7Mit40、 D11Mit4、 D 细胞STR鉴定 细胞 STR 鉴定 服务编 号 CES01 CES02 CES03 价格 周期 人类细胞 20 个 基因座检测 小鼠细胞检测 人鼠细胞交叉 污染检测 满足常规人类细胞鉴定 需要 特异检测小鼠细胞交叉 污染 检测人类细胞和小鼠细胞 交叉污染 1500 元 /株 1500 元 /株 2000 元 /株 3-5 工作 日 7 工作日 7 工作日 背景介绍： 应用于生物医学研究领域的哺乳动物细胞被错误鉴定和交叉污染的问题，一 直是一个普遍存在的突出问题。据统计，国外实验室有 20%左右的细胞株被错误 鉴定和交叉污染，NIH 和 ATCC 近两年都对此发出呼吁，要求研究者对细胞进行 鉴定。近年来，大量研究表明 STR 基因分型方法是进行细胞交叉污染和性质鉴 定的最有效和准确的方法之一，STR 基因分型应用于细胞鉴定已被 ATCC 等机 构强烈推荐。阅微基因作为 ATCC 标准委员会成员，在国内率先推出了细胞 STR 鉴定服务并与多家研究机构、细胞中心、生产厂商等建立长期合作关系。 高度丰富信息：同时分析多个 STR 基因座，可以准确的判断交叉污染和细 胞类型。 高度灵敏：可以检测最低 0.1ng DNA（约 15 个二倍体基因组），微量样本即 可满足需求，并且可以检测到早期污染。 高通量和系统化平台：采用自动化分析系统可大量检测及数据分析，结果更 加准确、客观。 服务项目： 1. 人类细胞 20 个基因座检测： 是目前基因座最多的检测服务，所选用的基因座不仅包含 ATCC 和 JCRB 细 胞库中的基因座，更添加 4 个高度多态性位点——D19S433、D6S1043、D12S391 和 D2S1338，可方便与权威数据库进行比对，具有极高的准确性。位点如下： D5S818 TH01 FGA D3S1358 D13S317 AMEL D18S51 Penta D D7S820 TPOX D21S11 D6S1043 D16S539 CSF1PO D8S1179 D12S391 vWA D19S433 Penta E D2S1338 2．小鼠细胞检测 利用阅微基因专利产品分析小鼠基因组中 8 个高度多态性位：D1Mit159.1、 D2Mit395.1、D4Mit170.1、D7Mit40、D11Mit4、D15Mit16、D 细胞STR鉴定 细胞 STR 鉴定 短串联重复序列（short tandem repeat，STR），又称为微卫星 DNA，重复 单位为 2-6bp，重复次数 10~60 多次，在 DNA 复制过程中的滑动、复制、修复过 程中滑动链与互补链的碱基错配，从而导致一个或几个重复单位的缺失或插入， 形成 STR 的多态性， 主要应用于遗传连锁图谱分析、 家系鉴定、 身份认证等领域， 同时也是鉴定细胞株被错误识别和交叉污染的主要工具。 细胞株被错误识别及交叉污染的现象还是比较普遍的， 虽然科研工作者使用 各种各样的传统方法来鉴定细胞，但细胞交叉污染的问题却有增无减。甚至有些 科研工作者在发表分数比较高的文章时，需补充细胞鉴定报告，这时发现细胞株 存被错误识别或者有交叉污染， 从而导致错误的结论，造成大量研究经费及时间 的浪费，并产生了大量无效或错误数据，对其他科研工作者产生误导。据统计， 国外实验室有 20%左右的细胞株被错误鉴定和交叉污染，因此对细胞株进行准确 鉴定和污染鉴定对研究者来说是必须正式、严肃关注的事情。2007 年 NIH 针对 这一情况发布了通知，强烈建议在使用培养细胞的时候进行鉴定。2008 年底， 专家提议 ATCC 致力于人源细胞系的鉴定工作，并制定鉴定的标准程序。 目前已开发出 20 个稳定， 且具有多态性的 STR 位点， D5S818、 即 D13S317、 D7S820、D16S539、vWA、TH01、AMEL、TPOX、CSF1PO、FGA、D18S51、D21S11、 D8S1179、 Penta E、 D3S1358、 Penta D、 D19S433、 D6S1043、 D12S391 和 D2S1338。 同时分析超过 15 个 STR 基因座，可以准确判断交叉污染和细胞类型；而且灵敏 度高， 可以检测最低至 0.1ng DNA(约 15 个二倍体基因组)， 微量污染也可检测； 同时具有高通量和系统化平台， 日处理量上千个检测，数据分析比对采用自动化 软件分析系统。 此外北京阅微基因技术有限公司作为 ATCC 标准委员会成员，在国内率先推 出了细胞 STR 鉴定服务并与多家研究机构、细胞中心、生产厂商等建立长期合作 关系。 并通过自己的专利产品开发出小鼠基因组中 8 个高度多态性位点，可用于 人鼠细胞株交叉污染的鉴定。推动的细胞 STR 鉴定的发展 细胞STR鉴定 细胞遗传质量鉴定检测 欢迎加讨论细胞系 STR 鉴定 QQ 群: 141437751 1. 细胞遗传质量检测的重要性 很多生物医药的研究都采用培养细胞来进行,这些细胞可能是受赠于其它研究人员,也可能是从细胞库 (如美国 ATCC,American Type Culture Collection)得来。据估计,15-20%的时间里,实验中所使用的细胞 已经不是原来的细胞系,或者与其它细胞系发生了交叉污染。显然,细胞系遭到污染、特征鉴别错误,将会极 大地威胁着基于这些细胞而发表的论文的质量和研究发现的正确性。为此,很多细胞库现在都要对提交来的 细胞系进行鉴定,并对细胞系之间的交叉污染进行监测。 一些机构已经认识到了交叉污染的问题,如 ATCC 和 FDA,这些机构要求对用于制药领域的实验中所使 用的材料 — 诸如细胞系 — 应该进行“身份鉴定”和纯度测试。Nature 杂志最近也要求报告新的人类胚 胎干细胞系的文章提供 STR 指纹图谱数据。 此外，FDA 建议研究人员在培养细胞的较早阶段(细胞培养第 一周)来鉴定细胞系的身份。细胞在被冻存前应再一次进行鉴定;对于活跃生长的细胞,每两个月应鉴定一 次;文献发表前也应对细胞系身份进行鉴定。如果一个实验室使用不止一种细胞系,则应在实验最开始时,就 要对所有的细胞系进行鉴定,以便排除交叉污染。 2 基于 STR 的方法可以轻松、快速地鉴定细胞身份 细胞培养中可以使用许多方法对交叉污染进行鉴定,如同功酶分析、染色体组分型、人淋巴细胞抗原 (HLA)分型和扩增片段长度多态性(AFLP)的特征分析。但是,比较好的方法是 STR 图谱法,在 ATCC,STR 分 析使用的是多重 PCR，可以同时扩增 8 个 STR 位点加 1 个性别决定位点 Amelogenin。每个被分析的人 源细胞系都有其独特的 DNA 重复模式,因此通过与基础图谱进行比对, 即可对每一批新细胞系的身份进行 确证。 STR 方法防止了 ATCC 将其 6 个“错误”细胞系进一步传播出去 — 因为经过 STR 分型后,发现 原本来自女性的细胞系中存在着 Y 染色体特异的扩增产物。 3 技术流程 3.1 STR 位点的选择 为了进一步提高鉴定的分辨率，我们除了包含 ATCC 检测的 8 个 STR 和 1 个性别决定位点 Amelogenin 外（表 1 中蓝色字 细胞中有机物的鉴定 智慧课堂课时教学任务单 必修一第二章 第 6 节细胞中有机物的检测与鉴定 【重点】1. 细胞中有机物鉴定的原理和实验步骤。 课时 重难点 2.体验生命科学以实验为基础的特性。 【难点】实验原理与操作步骤之间的相互关联。 【导课】如何确定混合物中是否含有某种成分。 【自学自填】 三. 脂肪的鉴定 四. 1.阅读课本 P18，完成《金版教程》P8 糖类鉴定的原理和实验步骤，对照 参考答案检查更正。 五. 2.生命活动离不开细胞 ①单细胞生物， 靠单个细胞就能完成 ； 多细胞生 物靠 密切合作，完成一系列的生命活动。 ②病毒一般由 ___ 和 组成， 所以无细胞结构的， 但是也需寄生 在 ，才能表现出生命特征。 3.草履虫是______动物，其运动和繁殖是由_________的运动和分裂来实 现的。人是由多细胞组成的，其发育的起点_________是一个细胞，其生 长和发育也是建立在_________的分裂和分化基础上的。缩手反射的完成 离不开_________、 _________等细胞， 遗传和变异离不开细胞内基因的传 递和变化。 4.生命系统的结构层次： 生命系统层次由小到大是： 、 、 、 、 。 其中最基本的生命系统是___________。而 、 、 、 、 【使用 说明与 学法指 导】 1. 依据学 习目标， 认真预习 课本至少 10 分钟， 用红笔标 注疑难和 重点 一. 糖类的鉴定 1.阅读课本 P18，完成《金版教程》P8 糖类鉴定的原理和实验步骤，对照 参考答案检查更正。 二. 蛋白质的鉴定 1.阅读课本 P18，完成《金版教程》P8 蛋白质鉴定的原理和实验步骤， 对照参考答案检查更正。 2 思考：比较斐林试剂和双缩脲试剂的异同点（独立完成下表） 。 项目 相同点 1. 2. 1. 不同点 2. 3. 4. 斐林试剂 双缩脲试剂 是最大的生态系统。 课堂任务表 【重难点探究】 结合初中教材知识和高中教材中以龟为例解释生命系统层次的知识点， 试着分析草履虫和植物的生命系统层次。 【知识梳理】 一、 是生物体结构和功能的基本单位 ， 并且只有在生物体的 内 特别注意： 病毒无 结构， 营养方式为 才能进行正常的生命活动。 二、生命系统的结构层次（黑体字的概念为学习重点） 细胞：是生物体 的基本单位，是 的 死活细胞的鉴别 （一）、死活细胞的鉴别 生活细胞近似无色透明，用普通光镜无法观察其形态，需用相差显微 镜来观察。 染色排除法：组织培养中检查死活细胞最常用的是“染色排除法”这类方 法简单但不甚严格，它只能判断细胞的代谢死亡，不反映细胞能否增殖。由于未 经过固定、专门染色，所以看不到死活细胞的形态差别。 所用染料的分类： 一般的生物染料不能穿过活细胞膜只有细胞被固定或细胞膜被破坏，染 料才能进入细胞膜。 第一类 ：死细胞着色，使死细胞着色的大部分是酸性染料。它们不容易 穿透活细胞的质膜，进入胞内，但却能渗透死亡的细胞，使之着色。如①台盼兰 （Trypan blue）：0.5-1%的台盼兰，pH7.0-7.2，每毫升细胞悬液加 0.1ml 染液，2 分钟后镜检，活细胞没有染上，死细胞全部被染成蓝色。②苯胺兰(Aniline’ black)： 0.05%的苯胺黑以 1：10 的量与细胞悬液混匀，1-2 分钟后，死细胞被染成黑色。 ③伊红 Y：细胞悬液与细胞悬液混喝，2 分钟后死细胞被染成桃红色。等。 第二类：活细胞着色，多为碱性染料，如中性红、健那绿、亚甲蓝、甲苯 胺蓝等。它们是一些无毒或毒性很小的染料，由于电性吸引而堆积在细胞中某一 特定的结构上从而显色，即它们解离后带正电，其中有的染料可与胞内某些结构 专一性的结合。 ①1%结晶紫染色生理 1%结晶紫盐水与细胞悬液 1：2 混合，立即镜检，或细胞被染成 蓝紫色，而死细胞不着色。属于活细胞染料。活细胞染料无毒，无物理、化学变 化，基本上不影响细胞的生命活动。 ②用呀啶橙染色可以鉴别出细胞固定前的死活状态。 丫啶橙是一种与 DNA 和 RNA 都能结合的荧光染料，在兰光或紫外光激发 下，DNA 可激发出 530nm 的荧光发射峰，RNA 可激发出 640nm 的荧光发射峰， 它与双链 DNA 的结合方式是潜入双链之间，而与单链 DNA 和 RNA 则由静电吸 引堆积在磷酸根上。在蓝光的激发下，细胞核发亮绿色荧光，核仁和胞质 RNA Page 9 发桔红色荧光。因此，原来的活细胞经固定、染色后细胞核呈亮绿色，核仁和散 布在细胞质中的 RNA 呈桔红色，胞质其余部分为淡红褐色。死亡的细胞，因物 质发生变形，其核呈暗绿色，胞质整个呈暗绿色。但丫啶橙的阳离子也可以结合 在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但由于经过细胞固定抑制了这种结合，从而主 要显 死活细胞的鉴定方法 活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。 细胞培养过程中要随时记录 细胞的生长情况，需要经常测定细胞的存活率；在肿瘤细胞的研究中，为了检验 各种药物对肿瘤细胞的杀伤力，也需要测定肿瘤细胞的存活率。在临床医学中死 活细胞的鉴定也有很大的应用，例如为了检测某一男子的生育能力，测定精子细 胞的存活力是比较常用的办法。 死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常 用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。但是通过直接的形态观察来鉴别细胞 死活，实验结果很容易受操作者的主观因素的影响，存在一定的误差，所以，在 实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。 不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理， 但无论采用何种办法， 都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。 常用的方法包括染色法和仪器分析法。 1 染色法 染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞 着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括： 死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起 保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通 透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝， 又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后 只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的 质壁分离也可鉴定死活。 死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝 是一种无毒染料， 氧化型为蓝色， 还原型为无色。 由于活细胞中新陈代谢的作用， 使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因 此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无 还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。 荧光素双醋酸酯（FDA）是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞原生质 体的生活力鉴定染料，其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异：FDA 本身 不产生荧光，也无极性，能自由渗透出入完整的细胞膜。当 FDA 进入活细胞后， 被细胞内的脂酶分解，生成有极性的、能产生荧光的物质——荧光素，该物质不 能自由透过活的细胞膜，积累在细胞膜内，因而使有活力的细胞产生绿 ES细胞鉴定方法(一) ES 细胞鉴定方法（一） 关键词：ES 细胞 人胚胎干细胞 干细胞 细胞 菌种保藏中心 atcc 中国微 生物菌种网 ES 细胞鉴定方法主要包括：形态学检测：碱性磷酸酶活性的检测；体内分 化实验；体外分化实验；核型分析法等方法。 一、形态学鉴定 ES 细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞核大，有一个或几个核 仁，胞核中多为常染色质，胞质少，结构简单。体外培养时，细胞排列紧密，呈 集落状生长。用碱性磷酸酶染色，呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色。细 胞克隆和周围存在明显界限， 形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较 强的脂状小滴。 细胞克隆形态多样， 多数呈岛状或巢状。 小鼠 ES 细胞的直径 7～ 18μ m；猪、牛、羊 ES 细胞的颜色较深，直径 12～18μ m；人 ES 细胞直径大约 14μ m。 二、碱性磷酸酶（AKP）活性 碱性磷酸酶活性的存在是细胞保持未分化状态的一个重要指标。 通过检测其 存在与否可进一步判定 ES 细胞。AKP 在早期胚胎的干细胞中活性较高，而在已 分化的细胞中活性明显降低。未分化的 ES 细胞具有较高的 AKP 活性，显示深蓝 紫色，而已分化的细胞及饲养层细胞不着色。非人灵长类和人胚胎干细胞 AKP 活性呈阳性，已分化的细胞呈弱阳性或阴性。 三、转录因子 Oct-4 的表达 转录因子 Oct-4 是一种发育全能性的标志基因， 为 POC 区域的一个转录因子。 在小鼠，Oct-4 只限定在多潜能细胞中表达。研究结果表明，受精卵所表达的 Oct-4 对建立 ES 细胞系是必需的。用 RT-RCR 方法分析发现人 ES 细胞也表达 Oct-4。当 ES 细胞分化时，其表达能力大大降低。Oct-4 可能是哺乳动物不同发 育阶段多潜能细胞所特有的少数特异的调控分子之一。 四、胚胎阶段特异性表面抗原的检测 在未分化的 ES 细胞表面存在有特异的抗原 SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4 等。其 中 SSEA-1 是早期胚胎阶段特异性细胞表面抗原。常用单克隆抗体 SSEA-1 检测 ES 细胞表面抗原作为发育全能性的一种标志。 五、核型分析 ES 细胞传代过程中需进行核型分析，检查细胞是否维持在二倍体状态。分 析时先在细胞培养液中加入一定浓度的秋水仙胺(0．1pg／ml)，使细胞同步在 M 期，然后用低渗溶液处理，经乙醇冰乙 NK细胞的鉴定 实验二 Percoll 不连续密度梯度沉淀法分离纯化 NK 细胞 实验原理 Percoll 是一种经聚乙烯吡喀烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，是一种新型密度梯度离心分离剂。 渗透压很低( 20mosm／kg H２O), 粘度也很小，可形成高达 1.3g／ml 密度，采用预先形成 的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由 于 Percoll 扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll 不穿透生物膜，对细胞无毒 害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的 活细胞分离。 【器材与试剂】 1． Percoll 溶液、8.5％ NaCl 或 1.5M PBS、PBMC。 2．10ml 试管、注射器、离心机。 【方法】 1．用 ficoll-hypaque 密度梯度离心法分离外周血 PBMC。 2．不同浓度(密度)Percoll 溶液的制备: 先用 9 份 Percoll 与 1 份 8.5％ NaCl 或 1.5M PBS 混 合制成等渗 Percoll 悬液，此悬液被认为是 100% Percoll 悬液， ，其密度为 1.1294g/ml。 ，然 后用生理溶液(0.85％ NaCl 或 0.15M PBS)稀释到 50%、47.5%、45%、42.5%和 40%五种不 同浓度。 （稀释度与密度线性相关。 ） 3．不连续密度梯度 Percoll 层的制备: 取一支 10ml 试管，先将试管壁用人血清湿润，除去 多余血清，这种预处理可使逐层叠加的 Percoll 液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。用 长针头注射器由下向上，从高密度向低密度逐层放置五种不同密度的 Percoll 悬液，每层 Percoll 悬液约 1.2～1.5ml。可将 Percoll 液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然 慢慢流下。 4． 装样： 向试管中缓慢加入从外周血中分离的 PBMC 悬液 1ml,细胞浓度为 1×108 细胞/ml。 5． 离心、 收集细胞： 2000r／min 离心 30min。 收集细胞： 一般 NK 细胞位于 42.5%与 45% Percoll 界面，以及上下二层的 Percoll 液中。当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层 去除 Percoll 液后收集界面 胚胎干细胞的鉴定方法 ＩＳ ６ ｌ５ ２ Ｃ ｌ ｌ７ ／ Ｓ Ｎ ｌ ７ 一 ９６ Ｎ ２ —４ ０ ｝围 临床 康 复 ２ ｏ 】 Ｏ ６年 ２月 ｌ 第 ｌ Ｏ日 Ｏ卷 第 ５期 １９ ８ ＮＢ ｎ ｒｐ ｉ ； Ｓ ｓ ｅ ｄ ｄ ｃ ｌ Ｉ ｏ Ｓ ｍａ ｓ ｆｒ ４ ５ ｄ ｙ ｏ Ｓ ａ ｄ ｔ ｒ ｓｎ ｕ ｐ ｎ ｅ ｕｔ ｆＥ ｓ ｌ — ａ ｓ ｔ ｕ ０ Ｅ ａ ｓ ＭＪ ａ ｆ ｄ Ｈ．Ｅ ｔｈｉｈ ｎ ｎ ｃ ｌ ｒ ｆｐｕ ０ｅ ｔ ｌｃ ｌ ＿ ｍ ｖ ｎ ，Ｋ ｕ ｍ＿ Ｍ ｎ ｓａ ｌ ｍｅ ｔｉ ｕｔ ｅ ０ ｌ ｐ ｔｎ ｉ ｅｌ ｆ ｓ ｕ ａ ｓｍ ｍ０ ｓ ｍｂ ｖ ｓ ， ｕ ｌ ８ ；９ ： ５ － ｕ ｅｅ ｒ０ ． ｖ ９ ｌ ２ ２ ｌ ４ ６ Ｄｏ ｔ ｈ ｎ Ｔ ｅｓ ｍａ ．Ｗ ｉｉｍ ．Ｍｅ ｄ ｃ ｌａ Ｐ ｌ ａ ａ Ｎ．Ｅ ｔｂｉｈ ｎ ｆｈ ｒｓｅ ｌｓ ｃ ｓ ｄ ． ｓａ ｌ ｍｅ ｔ０ ｒ ｔｌ ａｔ ｖｔ ｅ ｓ ａ Ｉ －ｂ ｏ ｆ ｒ ｓ ｌ Ｅ ｓ ｎ ｆ ｒ８ ｌ ａｓ（ ａ ｇ ｅｓｌ ｉ Ｖｒ ２ ０ ｎ ｉ ｅ Ｂ ｄａｔ 一 ｄ ｙ ｃ ｎ ｅｔ ｏ ｔ ｎｅｅｙ ｒ ｍｐ ａ ｅ ２ ｈ ｈ ｕｏ ｄ ｖ ） ａ ｖ ｓｃ ｌ ｒｂ ｄ ｈ ｃ ａ ｅ ｔ ０ ｌ ｍｉ ａ ｉ ｎ ｕ— ａ ｓ． ｅ ｉｕ ａ ０ ｖ ｗ ｉｈ ｈ ｓｃ ｎ ｍｌ ｅ ｏ ｃ ｃ ｖｔ ａ ｄ ｏ ｔ ｃ ｙ ｅ Ｕ ｓｍｉａ ｏ ｅ ｔｄｅ ｒ ０ ｄ ｂ ｅ ｎ． ｒｗａ ｉ ｌ ｒｔ ｃ ｏ ｒｎ ｃ ｕｌ ｅ ｓ ｅ ＤｉｌＩ ｔａ ｉｎ ｅ ｐ ｒ— ｆｅ℃ｎ ｉｔｏ ｘ ｅ ｉ ｆ ｖ ｄｅ ｂ ｖ ｎ ｃ ｓ ｍ （ Ｓ ｃ Ｕ ． Ｂ ９ ８； ２ ： ２ — ｅ ｍ ｒ０ ｉ ｔ Ｅ ） ｅ ｓ Ｄｅ ｅ Ｚｌ ８ ｌ ７ ２ ４ ７ Ｎ０ａ ａ ｎ ．Ｅ ｗａｄ Ｄ ｔ ｎ ｉＥ ｄ ｒ ，Ｗ ｉａ Ｋ，ｅ ｔ ｔ ￡ ．Ｄ ｖ ｔ ｎ